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1.仔細(xì)閱讀使用說明書。

2.提前從冰箱拿出標(biāo)記試劑盒各組分平衡至室溫。

3.用180μL組分B溶解組分A管中的生物素，充分溶解配制成10mM的生物素工作液

4.按照生物素標(biāo)記使用量計(jì)算所需添加生物素的量。

標(biāo)記使用生物素量的計(jì)算:標(biāo)記程度取決于蛋白質(zhì)上氨基的分布、蛋白濃度和所用試劑的量。實(shí)驗(yàn)分析表明待標(biāo)記蛋白或抗體的濃度在2mg/mL的時(shí)候，需使用20倍蛋白或抗體摩爾數(shù)的生物素;而當(dāng)?shù)陀?mg/mL的時(shí)候，則需要加入更高摩爾倍數(shù)的生物素，以確保蛋白或抗體分子中生物素的標(biāo)記水平。

 

用以下公式計(jì)算需要加入生物素的摩爾量:

mL protein x (mg protein/mLprotein) x (mmol protein/mg protein) x (mmol Biotin/mmol protein) x 20= mmol Biotin

然后計(jì)算需要多少微升10mM的生物素:

mmol Biotinx(1000000μL/L)x(L/10mmol)= μL Biotin

 

例:有1mL 2mg/mL的lgG溶液要標(biāo)記，則需要加入~27uL10mM的Sulfo-NHS-LC-Biotin。

1mL lgG x 2mg/mL lgG x (1mmol lgG/150000 mg lgG) x (1mmol Biotin/1mmol lgG)x 20= 0.000267 mmol Biotin

0.000267 mmol Biotinx(1000000uL/L)x(L/10mmol)= 26.7uL Biotin

1.取1mg 待標(biāo)記抗體于組分C超濾管中，并加入相應(yīng)體積的組分B，使抗體的終濃度為 2mg/mL。如果抗體濃度過低可以通過超濾離心濃縮至2mg/mL左右。如果待標(biāo)記物含有游離的氨基(Tris,氨基酸或者其他干擾物)，需要用組分B反復(fù)超濾確保其被去除干凈;

2.加入13.3μL生物素(10mM)工作液和適量組分B至上述超濾管中，使終體積為 0.5ml，并輕輕吹打混勻。恒溫37℃孵育 30min，期間可每隔10min吹打一次。(10mM生物素工作液最好一次性使用);

3.標(biāo)記到這一步已完成，盡管溶液中仍有過量未反應(yīng)的和水解的生物素試劑，已經(jīng)可以用 ELISA和 Western blot 實(shí)驗(yàn)初步測(cè)試標(biāo)記蛋白；

4.加入適量組分B至上述超濾管中，6000rpm離心10min。重復(fù)此操作至少4次;

5.收集超慮管中的溶液(即生物素標(biāo)記的抗體)。加入等量組分D保存至-20℃C冰箱或三分之二的組分D保存至-80℃冰箱中。

1.本試劑盒適用于所有含伯氨(-NH2)的大分子物質(zhì)的標(biāo)記(蛋白，抗體，多肽及其他含有伯氨基團(tuán)根據(jù)其分子量大小和標(biāo)記程度選擇合適的量);

2.本試劑盒配備了標(biāo)記物保存液組分D，其中主要成分為甘油。客戶也可以根據(jù)被標(biāo)記物的特點(diǎn)和用途不同，選擇更適合自己實(shí)驗(yàn)的保存液;

3.本試劑盒未開封前的有效期為12個(gè)月，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用,

4.本系列試劑盒提供的超濾管組分C為10KDa截留分子量和0.5mL的最大容積，客戶需要根據(jù)自己要標(biāo)記的物質(zhì)的分子量大小和標(biāo)記量選擇合適的超慮管?；蛘咛崆奥?lián)系我們以便提供您所需的超慮管規(guī)格;

5.10mM生物素工作液配置好后，最好一次性使用。剩余部分最多可在-20℃保存周，偶聯(lián)效率可能降低。